Microscopie

Caractères microscopiques des Vaginatae

Comme nous étudions essentiellement du matériel d’herbier, nous présentons ici le travail sur matériel sec. Le travail sur matériel frais s'avère nettement plus facile et tout particulièrement les coupes de trames de lames.

Microscopie des lames

Condition d'observation référentielle : au milieu de la lame.

Les coupes sont toujours faites vers le milieu de la lame. Elles doivent impérativement être fines, et l’usage d’un microtome de Ranvier facilite le travail ; sur matériel sec l'opération est difficile et le microtome de Ranvier devient indispensable ; il faut alors en réaliser plusieurs jusqu’à obtention de coupes convenables qui doivent être plus fines que l'épaisseur de deux basides. Si elles étaient trop fines on couperait basides et/ou articles physaloïdes en deux et le résultat serait inutilisable.

Au séchage, les articles physaloïdes rétrécissent, parfois considérablement, mais ils conservent leur position et l’angle qu’ils forment avec l’axe de la lame. Le matériel regonflé ne retrouve pas l’aspect du matériel frais mais on peut cependant reconstituer la lame originale.

Nous faisons la coupe sur matériel sec que nous transportons par voie liquide sur la lame.

Nous regonflons avec une solution aqueuse de potasse à 3 % que nous n'ajoutons qu'une fois l'échantillon recouvert par la lame couvre objet sous peine de voir la coupe s'enrouler irrémédiablement.

Après regonflement, il est possible de colorer au rouge Congo aqueux.

Une autre option consiste à regonfler la lame au "Ramolliseur GDS de Clémençon" avant la coupe. Dans ce cas seul le rouge Congo SDS peut convenir comme colorant.

Trame canonique chez les amanites et adaptation à l’étude de la section Vaginatae
Chez les amanites, la trame des lames est définie comme étant bilatérale et la forme canonique est la suivante, du centre vers l’hyménium (fig. 2 dans l'article Vaginatae partie I) : le médiostrate parallèle, à partir duquel divergent, à des angles plutôt marqués, les articles physaloïdes (cellules renflées) disposés régulièrement et constituant l’hyménopode ; puis le sous-hyménium, à la base des basides. On s’intéressera particulièrement au articles physaloïdes divergents, et on notera leur angle par rapport à l’axe central.

Dans la section Vaginatae, cette configuration « parfaite » n'est pas la seule, en voici deux autres :

1. La trame peut se réduire à un médiostrate filamenteux sans articles physaloïdes.

2. Il y a présence d'un médiostrate et d'un "pseudo-hyménopode" dans lequel les articles physaloïdes divergent d'un angle très faible.  L'expérience vous enseigne que pour une même espèce on peut rencontrer hyménopode et pseudo-hyménopode.

Nous donnons les définitions suivantes :
Trame des lames : ensemble des tissus se trouvant sous les basides et n'incluant pas le sous-hyménium (selon Tulloss, 1993).
Articles physaloïdes : dans le schéma de trame canonique des amanites, ce sont des cellules parfois très volumineuses, qui partent du médiostrate avec un angle de divergence variable et ne dépassent pas le niveau du sous-hyménium. Dans le cas des amanites de la section Vaginatae, ces cellules peuvent être terminales (acrophysalides typiques de la trame des Amanitales) ou intercalaires. Elles peuvent également être absentes.

Médiostrate : ensemble des hyphes et des cellules du centre de la lame, parallèles, orientées de la base de la lame vers l’arête. Le médiostrate peut, à la confluence avec l'hyménopode, contenir quelques rares cellules physaloïdes parallèles.
Hyménopode : entre le médiostrate et le sous-hyménium, c’est la partie qui contient des articles physaloïdes divergents. Lorsque cette divergence est très faible nous parlerons de pseudo-hyménopode.

Sous-hyménium : chaînes de petites cellules sous les basides, donnant naissance à ces dernières.

Caractères de la trame que l'on peut observer :
• présence ou absence d’acrophysalides (articles physaloïdes terminaux) ;
• angle des acrophysalides divergentes par rapport à l’axe central (fourchette) ;
• présence d’articles physaloïdes agglomérés parallèles aux hyphes du médiostrate, mais situés à la base des basides ;
• nombre de cellules de l’arbre sous-hyménial (fourchette entre minimum et maximum) ;
• nature du sous-hyménium (voir fig. 3 dans l'article Vaginatae partie I) ;
• épaisseur de la trame ;
• épaisseur relative des différentes strates ;
• forme particulière du profil de la lame en coupe.

Microscopie spécifique du sous-hyménium

Pour l’étude spécifique du sous-hyménium, nous donnons deux méthodes.

Méthode 1 :

Réhydrater un morceau fragment de lame , dans le ramollisseur GDS de Clémençon (1999). Le colorer et l'insérer de biais dans le microtome de manière à faire une coupe en biseau avec un angle aigü. Ne garder que la pointe et l'observer au microscope. 

Méthode 2 :

Reglonfler un tout petit morceau de lame dans un mélange rouge Congo ammoniacal + phloxine ou au KOH à 3 %. Lorsque le matériau devient souple, nous déchirons le morceau en fragments les plus petits possible à l'aide de deux aiguilles (travail de patience). Entre lame et lamelle nous écrasons modérément la préparation. A l'aide du petit grossissement nous cherchons les tous petits amas de basides que nous observons ensuite à l'immersion. Cette méthode permet aussi l'observation des basides.

Si le mélange ci-devant ne permet pas un assouplissement suffisant, passer ou KOH à 5 % ou au KOH  10 %.

 Types de sous-hyméniums selon C. Bas

Nous suivons Bas (1969) qui distingue quatre types de sous-hyménium (fig. 3, dans l'article Vaginatae partie I :
• rameux (type 1) : cellules étroites et rameuses dans le type 1-a ; dans 1-b,
il y a une projection horizontale, la cellule sous-hyméniale semblant plus ou moins perpendiculaire à la baside ;
• renflé-rameux (type 2) : renflées et rameuses 
• coralloïde (type 3) : cellules de formes très irrégulières, avec plus de projections que de connexions avec d’autres cellules ;
• cellulaire (type 4) : cellules plus ou moins isodiamétriques,
• en complément des types de C. Bas, nous avons encore rencontré le "type pachyvolvata" où la cellule sous-hyméniale comporte un renflement plus ou moins coudé

Microscopie du revêtement piléique

Le revêtement piléique des amanites consiste en un épiderme d'hyphes gélifiées en surface, très distinctes de la chair. Il repose sur un hypoderme qui peut être net ou indifférencié.

La présence ou l’absence apparente d’hypoderme est un caractère systématique à décrire soigneusement. Les acrophysalides se trouvent généralement nombreuses à la confluence de la chair et du revêtement piléique. Quand elles sont présentes dans le revêtement piléique elles sont petites et peu nombreuses. Il est intéressant de noter la densité d’hyphes oléifères dans le revêtement. Sur exsiccat, nous réhydratons généralement les volves dans le ramollisseur GDS de Clémençon. Pour observer les couleurs nous réhydratons au KOH.

Microscopie de la volve

Condition d'observation référentielle : la partie supérieure de la volve, près du bord.

(La partie inférieure ou moyenne peut contenir des restes de limbe interne voire de chair dans le cas où la volve aurait été détachée du stipe)

Nous effectuons nos coupes dans la partie libre de la volve, sans contact avec la chair, sauf, bien sûr, dans les volves entièrement adhérentes au pied. Sur exsiccat, nous réhydratons généralement les volves dans le ramollisseur GDS de Clémençon.

On distingue trois types de composition des éléments de la volve :
• filamenteuse : à éléments filamenteux fortement dominants ;
• cellulaire : à éléments renflés ou globuleux fortement dominants ;
• mixte : comprenant, dans des proportions variables, éléments filamenteux et éléments globuleux.

Nombre de couches ou strates de tissus : la volve peut être relativement homogène ou composée de deux voire de trois couches de tissus différenciées. La couche la plus externe, parfois colorée, peut être nettement distincte de la partie interne de la volve.

Disposition des éléments de la volve :
• Parallèles au pied : c’est le cas, par exemple, chez les amanites du clade Argentea. Les hyphes sont disposées individuellement (hyphes non agglomérées avec d’autres) ou groupées en faisceaux plus ou moins tressés.
• Emmêlées dans toutes les directions : nous distinguons plusieurs dispositions, les volves à filaments individuellement emmêlés, celles de faisceaux emmêlés et celles où les filaments sont contournés, entourant plusieurs fois les sphérocystes. Dans ce dernier cas, il y a toujours présence d’hyphes assurant la cohésion. La résistance mécanique dépend de la cohérence des tissus, c’est-à-dire du degré d’intrication des filaments et de la proportion de cellules renflées, mais aussi de l’épaisseur de la volve et du degré d’adhésion à la chair.
• Perpendiculaires au pied : la volve a tendance à se fissurer perpendiculairement à la surface (comme chez A. strobiliformis). Les verrues résultantes sont d’autant plus petites que la disposition perpendiculaire est régulière. Si les cellules ont tendance à se désolidariser, la volve devient pulvérulente.
Chez certaines espèces le voile primaire, vu au microscope, est coloré, les articles physaloïdes pouvant être pigmentés ou hyalins. Ce caractère a une valeur systématique. Nous conseillons de l’observer dans une solution aqueuse de potasse à 3 %. 
La présence d’hyphes oléifères doit être notée, ainsi que leur abondance et leur aspect (sur le frais de préférence).

Microscopie des spores

L’étude des spores d’amanites ne présente pas de difficultés particulières, mais il est néanmoins important de soigner la préparation microscopique. Certains échantillons peuvent présenter de grandes fluctuations dans la forme ou dans le quotient L/l des spores, ce dernier prenant par exemple toutes les valeurs entre Q = 1 et Q = 1,5. Il convient alors de mettre peu de liquide sur la préparation, car en s’échappant de la lamelle couvre-objet celui-là entraînerait avec lui les spores les plus légères, à coefficient Q élevé, laissant au centre les spores les plus massives et plus ou moins globuleuses. Les valeurs moyennes peuvent être fortement affectées par ce problème.